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顯色瓊脂培養(yǎng)基用于檢測(cè)食品中的腸桿菌科

更新時(shí)間:2018-09-19  |  點(diǎn)擊率:1737

介紹

腸桿菌科、大腸桿菌和大腸菌群是常見(jiàn)的食品傳染性細(xì)菌。對(duì)這些病原體的檢測(cè)和量化是微生物食品和臨床診斷實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)重要任務(wù)。

 

包括生化鑒定在內(nèi)的傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法已經(jīng)應(yīng)用了很長(zhǎng)時(shí)間。這些方法耗費(fèi)時(shí)間和試驗(yàn)材料。以前的研究顯示,大腸菌群,特別是大腸桿菌可作為食品和水污染的指示菌。它們的存在標(biāo)示著飲用水和食品也受到了其他腸道病原菌的污染。因此在檢測(cè)食品衛(wèi)生方面,它們的分離和計(jì)數(shù)具有非常重要的作用。

 

ISO 6579-2003 描述了有關(guān)沙門氏菌在食品和飼料中的檢測(cè)方法,它一共包括四個(gè)步驟,并且需要確證試驗(yàn),需要持續(xù)5-7天,即:1.非選擇性液體培養(yǎng)基中的前增菌;2.液體培養(yǎng)基中的選擇性增菌;3.接種選擇性培養(yǎng)基;4.對(duì)可疑菌落進(jìn)行血清學(xué)和生化鑒定。

 

沙門氏菌屬是導(dǎo)致胃腸炎的常見(jiàn)原因,對(duì)于它的檢測(cè),需要從糞便樣本中分離病原菌。傳統(tǒng)使用乳糖、pH指示劑,用于鑒別沙門氏菌(非乳糖發(fā)酵菌)。然而,經(jīng)常有必要篩選許多其他的共生菌,如變形桿菌,它也不能發(fā)酵乳糖。篩選共生菌是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程,并且所需的血清學(xué)和生化鑒定試劑比較昂貴。

 

對(duì)天然污染食品樣品的分析顯示,用顯色培養(yǎng)基對(duì)菌落計(jì)數(shù)和分離更加容易,特別是對(duì)蠟樣芽孢桿菌。顯色培養(yǎng)基中包含人工添加的顯色底物,可被一些微生物特異的活性酶所裂解。

 

在過(guò)去30年中,一些病原菌靶向的高特異性顯色培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)出來(lái)了。這些培養(yǎng)基采用了酶底物,經(jīng)水解后釋放出生色染料,導(dǎo)致病原菌形成帶顏色的菌落,可輕易地與共生菌群相鑒別。理想狀況時(shí),共生菌群應(yīng)被選擇性因子*抑制,或形成無(wú)色菌落,從而使靶向病原菌從背景菌群中“脫穎而出”。因此,它可區(qū)分含有這種酶的微生物和不含有這種酶的微生物。當(dāng)樣本含有多種菌群時(shí),這一點(diǎn)對(duì)于檢測(cè)特定的病原菌特別重要。而底物和水解產(chǎn)物對(duì)微生物生長(zhǎng)不應(yīng)有抑制效應(yīng)。本次研究旨在評(píng)估兩種顯色培養(yǎng)基對(duì)于從食品中檢測(cè)和分離腸桿菌科的效率。

 

材料與方法

 

培養(yǎng)基制備

腦心浸出液肉湯(BHI,Difco labortaries, USA),選擇性培養(yǎng)基用于革蘭氏陰性菌,麥康凱瓊脂(Fluka BioChemika),EMB瓊脂(HiMedia Laboratories)和四硫磺酸鈉煌綠肉湯(OXOID)用于大腸菌群和腸道致病菌,而亞硫酸鉍瓊脂(HiMedia)、HE瓊脂(OXOID)、XLD瓊脂(BD)和SS瓊脂(Biolife)用于分離沙門氏菌屬。

 

兩種用于檢測(cè)大腸桿菌和其他大腸菌群的顯色培養(yǎng)基進(jìn)行了制備,分別為HiCrome ECC瓊脂(HIMEDIA)和沙門氏菌鑒別瓊脂(Raj Hans Medium, HIMEDIA)。每種顯色培養(yǎng)基制備時(shí)煮沸而不用高壓滅菌。

 

食品樣本

46個(gè)不同的食品樣本(雞蛋、色拉、奶制品、肉和加工過(guò)的大米)從伊拉克首都巴格達(dá)的當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上購(gòu)買。

 

用不同培養(yǎng)基分離細(xì)菌

每種樣本取25g加入到225ml生理鹽水,每種0.1ml樣本均液制備3個(gè)稀釋度,分別在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。平板在37度孵育24小時(shí),使顯色培養(yǎng)基中充分顯色。

 

生化分析

指數(shù)生長(zhǎng)期的分離菌落用API 50 CHL試劑盒(梅里埃)進(jìn)行分析,遵循說(shuō)明書進(jìn)行。

 

結(jié)果和討論

檢查了46種不同食物樣本。所有46個(gè)樣品都包含腸桿菌科的混合菌群,其中大腸桿菌(n=28)、肺炎克雷伯氏菌(n=7),沙門氏菌屬(n= 30)。在ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂菌上,每個(gè)分離的菌落都表現(xiàn)為特定顏色。食品樣品的貯溶液含有多種類型的細(xì)菌,ECC瓊脂上鑒別的顏色如圖1所示。ECC上的大腸桿菌呈藍(lán)紫色(圖2)。

 

圖1.

 

 

 

圖2.

 

沙門氏菌在兩種顯色培養(yǎng)基上表現(xiàn)為:腸炎沙門氏菌在ECC上為無(wú)色菌落(圖3A),傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上是粉紅色(圖3B)。

 

 

圖3A

 

 

圖3B

 

肺炎克雷伯氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上為藍(lán)色菌落(圖4A),在ECC上為綠色(圖4B)。

 

圖4 A

 

 

 

圖4 B

 

對(duì)分離的菌落初步鑒定是基于革蘭染色。麥康凱瓊脂能從形態(tài)上檢測(cè)到腸桿菌科。從食品樣本接種到增菌培養(yǎng)基如腦心浸液肉湯、麥康凱瓊脂、EMB瓊脂、BS瓊脂、HE瓊脂、TB肉湯、XLD瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基上都出現(xiàn)腸桿菌科的大量生長(zhǎng),這使得難以分離疑似細(xì)菌。在比較用于腸桿菌科檢測(cè)的顯色培養(yǎng)基時(shí),發(fā)現(xiàn)ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂適合腸桿菌科成員,并適合用作食品中腸桿菌檢測(cè)的指示培養(yǎng)基。用顯色培養(yǎng)基(ECC沙門氏菌鑒別瓊脂)替代麥康凱瓊脂和EMB瓊脂培養(yǎng)基,會(huì)使背景菌下降大約50%,然而并不減少待測(cè)菌的菌落數(shù)量。

 

有趣的是,來(lái)自食物樣本的背景菌群受到強(qiáng)烈抑制。使用顯色培養(yǎng)基分離的沙門氏菌菌落,通過(guò)多價(jià)沙門氏菌抗血清得到證實(shí),其血清型為特定的O和H。分離株的終確任是通過(guò)API 50試劑盒來(lái)確定腸桿菌科成員的糖發(fā)酵能力。它可用于腸桿菌科成員的鑒別。

 

近年來(lái),生物技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)導(dǎo)致食品檢測(cè)技術(shù)的改變。今天,我們受益匪淺于那些比傳統(tǒng)方法更特異、更快速且通常具有更高靈敏度的方法。含有乳糖的培養(yǎng)基,加上pH指示劑,傳統(tǒng)上用于從共生菌如大腸桿菌中鑒別出沙門氏菌。傳統(tǒng)顯色的原理是基于糖發(fā)酵,產(chǎn)生局部pH下降引發(fā)培養(yǎng)基中的指示劑顏色的變化??偟膩?lái)說(shuō),我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,兩種類型的顯色培養(yǎng)基有利于快速檢測(cè)食物中的細(xì)菌,并具有高度選擇性,不需要高壓滅菌,而傳統(tǒng)培養(yǎng)基則需高壓滅菌,非常耗時(shí),而且價(jià)格貴,選擇性差。這些結(jié)果與其他人報(bào)告相一致(見(jiàn)注1)。

 

分離鑒定食品源性菌如腸桿菌科,在顯色培養(yǎng)基上為適合,這是因?yàn)橛捎谶@些菌的代謝活性與培養(yǎng)基中的底物反應(yīng),使菌落產(chǎn)生顏色而得以分離。在許多研究中,顯色培養(yǎng)基已被證實(shí)顯示出超過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì),無(wú)論是目標(biāo)病原菌的檢測(cè)率上,還是混合菌群的區(qū)分上。顯色培養(yǎng)基因?yàn)榘@色底物,肯定要比傳統(tǒng)培養(yǎng)基更貴,但這可以通過(guò)減少對(duì)補(bǔ)充試劑的需求、減少與平板制備以及可疑菌落鑒定相關(guān)的勞動(dòng)時(shí)間來(lái)抵消。由于這些因素,在診斷實(shí)驗(yàn)室中使用顯色培養(yǎng)基日益廣泛。很可能在未來(lái)幾年內(nèi)針對(duì)更廣泛的病原體分離的顯色培養(yǎng)基越來(lái)越多。Hicrome ECC瓊脂和沙門氏菌鑒別瓊脂在快速檢測(cè)食品病原菌方面就是其中兩款翹楚。

結(jié)論

從這項(xiàng)研究中可見(jiàn),ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂顯示中高特異性和靈敏度,這與其他報(bào)告一致。然而,該研究的局限是只采用了兩款篩查腸桿菌的顯色培養(yǎng)基。也可能有其他替代品用于更便宜地對(duì)腸桿菌科進(jìn)行日常檢查,以促進(jìn)傳染病防控措施的啟動(dòng)。

 

 

 

注1. Obeng-Nkrumah N, Twum–Danso K, Krogfelt KA, Newman MJ(2013). High levels of extended spectrum beta lactamase in a amajor teaching hospital in Ghana: The need for regular monitoring and evaluation of antibiotic resistance. Am. J. Trop. Med. Hyg. 98:960-964.

 

注2.該論文中提到的HiMedia生產(chǎn)的兩款顯色培養(yǎng)基,具體為

 

HiCrome ECC Selective HiVeg Agar Base(貨號(hào)MV1294)(需添加劑,貨號(hào)FD190)

 

Salmonella Differential HiVeg Agar(貨號(hào)MV1078)

出處:非洲微生物學(xué)研究(African Journal of Microbiology Research). 2015,9(49): 2354-2357

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